Создать новый ген за один день или даже за несколько часов? Ещё недавно это казалось немыслимой задачей, однако новая технология сделала мечту многих учёных реальностью.
Команда из Калифорнийского университета и Национальной лаборатории имени Лоуренса в Беркли представила методику, которая позволяет имитировать процесс синтеза ДНК.
Авторы разработки поясняют, что вопрос о создании ДНК изучается уже более 40 лет. Традиционный подход использует нуклеотиды – строительные блоки ДНК, которых существует всего четыре типа – аденин, гуанин, цитозин и тимин. Их нужно добавлять в определённой последовательности к олигонуклеотиду – короткому базовому фрагменту ДНК. Таким образом можно нарастить полноценную цепочку.
Однако этот метод предполагает использование токсичных органических реагентов. Кроме того, из-за высокой вероятности ошибок созданная таким образом цепь ДНК ограничивается лишь 200 основаниями. В масштабах существующих природных генетических кодов это число можно назвать ничтожным. Чтобы собрать даже небольшой ген, исследователям приходится синтезировать его по частям, а затем "сшивать" их вместе, это требует много времени и немалых затрат.
Молодые учёные из США предложили принципиально новый подход, который за быстроту и принцип действия назвали "ДНК-печатью".
"Если вы инженер-механик, очень здорово иметь трёхмерный принтер, который может распечатать деталь за одну ночь, чтобы вы могли проверить её на следующее утро. Если же вы исследователь или биоинженер, и у вас есть инструмент, который упрощает синтез ДНК, вы можете быстро проверить свои идеи и исследовать новые. Думаю, это приведёт к множеству инноваций", — рассказывает соавтор работы Дэн Арлоу (Dan Arlow).
Совместно с приглашённым из Германии коллегой Себастианом Паллуком (Sebastian Palluk) он работал над методами применения ДНК-синтезирующего фермента, который содержится в клетках иммунной системы и позволяет добавлять нуклеотиды к существующей молекуле ДНК. Важное условие: процесс должен происходить в воде, потому что именно в такой среде ДНК наиболее стабильна.
По словам биоинженеров, новый метод повышает точность работы, и в итоге можно создавать нити ДНК длиной до нескольких тысяч оснований. Это размер полноценного среднестатистического гена.
"Мы разработали новый способ синтеза ДНК с применением механизма, который сама природа использует для создания ДНК. Этот подход является многообещающим, потому что ферменты эволюционировали в течение миллионов лет, чтобы достичь высокой "химической точности", — отмечает Паллук.
Он поясняет, что большинство клеток в живых организмах, как правило, не синтезируют ДНК с нуля. Они копируют её с помощью множества различных ферментов, называемых полимеразами, на основе шаблонов, заложенных в клетке при её рождении.
Ещё в 60-х годах учёные обнаружили необычную полимеразу, которая не полагается на существующую ДНК-матрицу, а беспорядочно добавляет нуклеотиды к генам. Таким способом создаются антитела иммунной системы с миллионами генетических вариаций. Благодаря этому механизму они учатся атаковать самые разные патогены.
Фермент, о котором идёт речь, известен как терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза (TdT). Он способен добавлять к цепочке ДНК все четыре вида нуклеотидов, наращивает до 200 оснований за минуту, а его использование сводит к минимуму число побочных реакций.
Но есть важный нюанс: TdT добавляет новые буквы к генетическому коду в случайном порядке. Исследователи давно искали способы контроля, чтобы создавать нужные последовательности, и теперь решение найдено.
Арлоу и Паллук начали с того, что добавляли к нуклеотидам химические группы, которые действуют как "стоп-сигналы". В результате фермент мог прикрепить к базовому фрагменту ДНК лишь один нужный нуклеотид. После этого нить ДНК обрабатывали специальным соединением, смывающим "стоп-группу", и подготавливали к прикреплению нового основания.
Но и в этом случае исследователи столкнулись со сложностями: оказалось, что TdT очень придирчив. Прикрепление модифицированных "стоп-группами" оснований занимало очень много времени, поэтому команда немного изменила подход.
Они добавили блокирующую химическую группу не к нуклеотиду, а к самому ферменту TdT. Затем его связывали с нуклеотидами, а их добавляли к базовому фрагменту ДНК олигонуклеотиду. В итоге фермент, прикрепляя основание к молекуле ДНК, оставался привязанным и сам блокировал образование любых дополнительных копий.
После того как молекула ДНК получает новое основание, остаётся лишь "разрезать связующий трос", чтобы высвободить фермент, и разблокировать конец нити для добавления нового нуклеотида, также содержащего свой фермент, пишут авторы.
Такой подход оказался менее затратным (ферментом TdT с учёными поделились культуры бактерий и дрожжей), а также быстрым. Присоединение нового нуклеотида к базовой молекуле занимает от 10 до 20 секунд, а на то, чтобы разблокировать конец цепочки для добавления нового основания, уходит ещё минута.
Правда, авторам ещё предстоит повысить точность технологии. Пока что она составляет 98%, в то время как классические методы синтеза ДНК точны на 99%. По мнению экспертов, чтобы создать "правильную" молекулу ДНК с тысячей оснований, потребуется 99,9% точности.
Если специалистам удастся достичь таких показателей, новый метод произведёт настоящую революцию в синтетической биологии, а также подарит возможность упаковывать гигантские массивы данных в компактные ДНК-архивы (об этой технологии "Вести.Наука" (nauka.vesti.ru) подробно рассказывали ранее).
Кроме того, перестройка генов микроорганизмов позволит создавать новые медицинские препараты, а также топливо.
Более подробно об этой работе рассказывается в статье, опубликованной в журнале Nature Biotechnology.
Добавим, что ранее исследователи открыли новую форму ДНК в живых клетках, которая сильно отличается от привычной спирали, а также внедрили две искусственные буквы ДНК в геном живого организма. Последствия этого эксперимента оказались неожиданными.
